靶向蛋白质降解（TPD）是通过诱导E3泛素连接酶与靶向蛋白质接近，从而促进靶标的泛素化以及随后的蛋白酶体降解。这一技术逐渐成为一种新兴的治疗工具，在处理致病蛋白方面展现出巨大的潜力。过去，TPD主要通过两种方式实现：第一种是利用蛋白质降解-靶向嵌合体（PROTACs），即两个独立功能模块的化合物，分别与目标蛋白和E3连接酶结合；第二种是通过单价结合连接酶或靶点的分子胶。

在本文中，我们将重点介绍一种新型的BRD4双功能降解剂——分子内双价粘合剂（Intramolecular Bivalent Glues, IBGs）的作用机制，展示了靶向蛋白质降解的新模式。与PROTACs以trans构象连接目标蛋白和E3连接酶不同，IBGs通过cis构象同时连接目标蛋白的两个相邻结构域，显著增强与E3连接酶的表面互补性。这种构象变化利用了目标蛋白与连接酶之间的天然亲和力，将BRD4“粘”附于E3连接酶DCAF16上，进而实现BRD4的降解，而在没有这种化合物的情况下，降解过程将无法发生。

通过解析BRD4–IBG1–DCAF16三元复合物的结构，我们的研究进一步指导了更高效降解剂的理性设计，使其效力提升至低皮摩尔级别。为了评估BRD4与DCAF16之间的三元复合物的形成，我们采用了时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）分析法，该方法使用针对BRD4的铕标记抗体和Cy5标记的DCAF16。

如果IBG分子诱导标记的BRD4与DCAF16之间形成三元复合物，则荧光团之间的距离会近到足以形成荧光共振能量转移（FRET）对。激发铕供体荧光团的同时，能量转移会导致Cy5受体荧光的产生，后者可以用酶标仪测量。我们在TR-FRET分析中，Cy5标记的DCAF16、His-BRD4及铕标记抗His供体的储备溶液均配制在TR-FRET缓冲液中进行实验，旨在探讨IBGs对三元复合物形成和稳定性的影响。

本研究的核心目标是表征DCAF16、BRD4与双价分子胶IBG1之间的相互作用。通过对这些相互作用的等温滴定量热法（ITC）分析，IBG1不仅形成了BRD4Tandem与DCAF16的三元复合物，还展示了在IBG1存在时，DCAF16与BRD4Tandem之间的亲和力显著增强（Kd由4μM降至0.6μM）。

进一步的TR-FRET稳定性分析显示，在IBG1存在时，滴定DCAF16至BRD4Tandem引起的复合物形成（Kd=712nM）验证了其有效性。这种分子内“胶合作用”的机制为发展新型靶向药物提供了新的方向，特别是在针对多种效应蛋白、重构细胞信号通路以及推动蛋白质降解等方面，提供了丰富的药理学前景。

我们还在确认IBG1作用机制的基础上，合成了新化合物IBG3，进一步提高了对BRD4和DCAF16的结合活性。IBG3在降解BRD4方面表现出优于IBG1的性能，其降解效率达到了低皮摩尔水平（DC50=67pM）。这为进一步优化靶向蛋白质降解的策略奠定了基础。

总结而言，本文通过TR-FRET相互作用分析方法表征了BRD4-DCAF16之间的新型分子胶，这种分子内双价胶通过同时结合目标蛋白的两个结构域，增强了其与E3连接酶的亲和力，从而形成新型的相互作用模式。这一策略为靶向蛋白质降解提供了新的药理学路径，具有潜在的临床应用前景（南宫28）。