第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值

在进行基因表达的相对定量测定时，内参基因的选择非常关键。如以下几点：

1. 始终选择表达丰盛且稳定的基因作为内参基因。
2. 请勿盲目选择常用的内参基因。
3. 常用的内参基因包括：GAPDH、Actin、Tublin。

内参基因的适当选择直接关系到实验结果的有效性。引入内参基因后，可以进行结果的计算。

二、绝对定量

绝对定量是根据标准品测定样品中基因表达的绝对值（拷贝数）。

标准品的选择包括：

1. A/克隆质粒
2. B/PCR产物
3. C/cDNA（进行扩增效率测定等用途，但绝对定量时不建议使用）

拷贝数的计算需要考虑平均分子量（MW）。具体计算方式如下：

• 双链DNA（dsDNA）：拷贝数 = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)
• 单链DNA（ssDNA）：拷贝数 = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)
• 单链RNA（ssRNA）：拷贝数 = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)

拷贝数计算公式为：

(6.02 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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